Модельные организмы, генетические манипуляции и моделирование заболеваний. Группы модельных организмов для изучения генетических заболеваний человека.


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
Модельные организмы,
генетические манипуляции и
моделирование заболеваний
Модельные организмы
-
организмы, используемые в качестве
моделей
для изучения тех или
иных свойств, процессов или явлений живой природы

Позволяют проводить эксперименты,
невыполнимые на людях

Живые организмы проявляют высокую
степень сходства на молекулярном уровне,
некоторые гены могут сохраниться входе
эволюции у далеких видов
Характеристики модельных
организмов

Хорошо изучены

Легко содержать и разводить в лаборатории

Короткое время генерации

Легкодоступны для классических
экспериментов по скрещиванию, а также
прямого манипулирования с геномом

Близкое к человеку положение на
филогенетическом древе
Группы модельных организмов для изучения
генетических заболеваний человека
Класс организмов
Преимущества
Недостатки и ограничения
Приматы
Близки к человеку генетически,
биохимически
и физиологически.
Сходное строение мозга.
Дорогостоящие исследования.
Длительный
цикл развития,
малочисленное потомство. Этические
проблемы.
Другие
млекопитающие
Относительно близки
к человеку на
разных уровнях. У грызунов короткий
цикл развития и многочисленное
потомство.
Кроме грызунов,
длительный
цикл
развития, малочисленное потомство.
Некоторые заболевания невозможно
моделировать.
Другие
позвоночные
Хорошие модели для изучения
ранних стадий эмбрионального
развития.
Короткий цикл развития и
многочисленное потомство.
Сложности с генетическими
манипуляциями. Отсутствуют
ортологи
многих генов человека.
Беспозвоночные
C.
elegans
и
D.
melanogaster
очень
легко разводить в лабораторных
условиях и проводить генетический
анализ. Подходят для
изучениямоделей
заболеваний на
клеточном уровне.
Эволюционно далеки от человека,
следовательно отличаются
многие
процессы и отсутствуют
ортологи
многих генов.
Human gene
Drosophila gene
Affect when mutated
Hox genes
Hox genes
Alteration of anterior
-
posterior identities
PAX6
eyeless
Defects of the eyes
SALL1
salm or salr
Defects of the
auditory system
TWIST1
twist
Malformations of
mesodermal
derivatives
NKX2
-
5
tinman
Defects in heart
specification and
function

Дрожжи
Saccharomyces
cerevisiae

Плодовая мушка
Drosophila
melanogaster

Нематода
Caenorhabditis
elegans

Рыба
Danio
rerio

Мышь
Mus
musculus
Humans
Animal models
Mutant Gene
Mutant or missing
Protein
Mutant Phenotype
(disease)
Mutant Gene
Mutant or missing
Protein
Mutant Phenotype
(disease model)
Humans
Animal models
Mutant Gene
Mutant or missing
Protein
Mutant Phenotype
(disease)
Mutant Gene
Mutant or missing
Protein
Mutant Phenotype
(disease model)
Sequence analysis (BLAST) can connect
animal genes to human genes
Humans
Animal models
Mutant Gene
Mutant or missing
Protein
Mutant Phenotype
(disease)
Mutant Gene
Mutant or missing
Protein
Mutant Phenotype
(disease model)
Relating phenotypes
Фенотип модельного организма исследуется,
исходя из проявления заболевания у человека

Анатомические, морфологические,
гистологические исследования

Метаболические, физиологические,
поведенческие тесты

Молекулярно
-
генетический анализ
экспрессии (как уровень экспрессии, так и
ее локализация)

Получение и исследование клеточных
линий
Анатомическое и морфологическое
фенотипирование
модели заболевания
Ellis

van
Creveld
syndrome
Трансгенные
организмы

Экзогенная ДНК внедряется в геном клеток
зародышевого пути

Для изменения генома модельных
организмов разработано множество
методов

Трансген

чужеродная ДНК используемая
при
трансгенезе
Способы введения
трансгенов

Микроинъекция
в
пронуклеус

Перенос генов в гаметы и предшественники
половых клеток

Перенос генов в
плюрипотентные
клетки
эмбриона или культивируемые
плюрипотентные
клетки

Перенос генов в соматические клетки
(клонирование)
Различные способы получение генетически
модифицированных мышей
Микроинъекция
в
пронуклеус
Somatic cell nuclear
transfer
Регуляция
трансгена
на уровне
экспресии

Экзогенные промоторы позволяют
регулировать экспрессию
трансгенов

На экспрессию
трансгенов
может влиять
эффект положения и структура
трансгенного
локуса
Индуцибельная
экспрессия
трансгенов
Tetracycline
-
inducible expression
Tamoxifen
-
inducible expression
(уровень транскрипции)
(уровень трансляции)
Таргетная
модификация генома

Gene targeting

модификация
определенного гена/генов организма

Chromosome engineering

крупные
модификации ДНК
Таргетинг
генов с использованием
эмбриональных стволовых клеток
Подходы к
таргетингу
генов для создания
«нулевых» аллелей или более мягких мутаций
1.
Gene knockouts

полное выключение гена
2.
Gene knock
-
ins

выключение гена с
внедрением
репортерного
гена (
lacZ
, GFP
)
3.
Создание точечных мутаций
4.
Кондиционная
инактивация
генов
Исследование функций гена, моделирования заболеваний
Используется процесс гомологичной рекомбинации (кроме п. 4)
Позитивно
-
негативная селекция для отбора
стволовых клеток с желаемым генотипом
Knock
-
in
Замена только первого
экзона
Выключение гена и локализация его
нормальной экспрессии
GFP
Кондиционная
инактивация
генов

Инактивация
в определенных тканях или в
определенное время

Для изучения генов, жизненно важных на ранних
стадиях развития или в некоторых тканях

Используются
сайт
-
специфические
системы
рекомбинации микроорганизмов
Кондиционная
инактивация
генов с
использованием системы
Cre
-
loxP
Возможно создание
индуцибельного
Cre
трансгена
Chromosome engineering

Создание крупных хромосомных
перестроек

Для моделирования хромосомных
заболеваний человека

Используются
сайт
-
специфические
системы
рекомбинации микроорганизмов
Chromosome engineering
Таргетная
инактивация
гена с использованием
нуклеаз с «цинковыми пальцами»
Таргетная
инактивация
генов на
уровне РНК

Gene knockdown

Не требуется получения
трансгенных
животных
1.
Интерференция РНК
2.
Морфолиновые
антисмысловые
олигонуклеотиды
Случайный мутагенез

Для внесения случайных мутаций в геном

Получение большого количества мутантов,
последующая фенотипическая селекция и
анализ генотипа
1.
Химический мутагенез
2.
Инсерционный
мутагенез

Gene trapping (
ловушка гена
)

Транспозонный
мутагенез
Алкилирующие
агенты
Анализ генотипа при химическом
мутагенезе

Гетеродуплексный
анализ

NGS
Gene trapping
Метод похож на
knock
-
in
, но встройка происходит случайно
Транспозоновый
мутагенез
Использование
трансгенных
животных для
моделирования заболеваний человека и
изучения функций генов

Генетические,
аутоимунные
заболевания, рак,
инфекционные заболевания

Среди генетических чаще исследуются
моногенные
заолевания
, реже

мультифакторные
, хромосомные

Мышь

наиболее популярные модельный
объект

Беспозвоночные используются для
исследования клеточной или молекулярной
основы заболевания
Human disease genes in model organisms
Мутации потери функции
Loss
-
of
-
function

Моделируются при селективной
инактивации
ортологичного
гена

Чаще рецессивные
1.
Нулевый
аллели, кондиционная
инактивация
2.
Гуманизированные
аллели (
humanized allele
)
3.
Ликовые
мутации (
leaky mutations
)
Мутации приобретения функции
Gain
-
of
-
function

Моделируются при экспрессии мутантного
трансгена

Чаще
моногенные
, онкогенные
Моделирование хромосомных
заболеваний

Делеции
и дупликации относительно
небольшого размера
модилируются
при
помощи хромосомной инженерии

Нарушение числа хромосом моделировать
сложно из
-
за ограниченной
синтении
хромосом человека и мыши
Моделирование синдрома Дауна с использованием
сегментной
трисомии
16
хромомсомы
Моделирование
синдорома
Дауна с
использованием
трансхромосомных
мышей
Моделирование онкологических
заболеваний

Knockouts
для моделирования потери
функции
онкосупрессора

Модели активации онкогенов

Моделирование спорадического рака
Трудности в повторении фенотипа
человека на мышах

Отличия в наборе генов

Отличия в генетическом фоне

Отличия в регуляции и
экспресии
генов

Отличия в биохимических и
метаболических путях

Отличия в клеточной физиологии и
развитии
и
тд
.
Гуманизированные
мыши

Линии мышей, в которых нивелированы те
или иные отличия от человека в
физиологии, биохимии и
тд
eyeless/Pax
-
6
genes
Pax
-
6
mRNA
in situ
hybridisation
in human fetus
Achondroplasia
Fibroblast growth factor receptor (FGFR)
Выводы

Модельные организмы важны для изучения функций
генов, понимания механизма заболевания,
тестирования новых препаратов.

«Полезность» модельного организма зависит от многих
факторов: эволюционную близость, практические
преимущества и ограничения, этически проблемы.

Черви и насекомые используются для анализа на
клеточном уровне, рыбы и мыши

на более высоком.

Генетические манипуляции, как правило, заключаются
во внедрении чужеродной ДНК в клетки зародышевого
пути для получения
трансгенного
организма.

Микроинъекции
в
пронуклеус
часто используются для
внедрения чужеродного гена (нормального или
мутантного).

Модификация эндогенных генов может осуществляться
методом
таргетинга
генов или случайным мутагенезом.

Таргетинг
генов основан на процессе гомологичной
рекомбинации в клетке.

Сайт
-
специфическая
рекомбинация позволяет
контролировать место и время экспрессии
трансгена
.

Кондиционные нокауты позволяют выключать
жизненно важные на ранних стадиях развития гены.

На модельных организмах также изучаются крупные
хромосомные перестройки.

Возможно выключение генов на уровне РНК, а не ДНК.

При крупномасштабных экспериментах по мутагенезу
зачастую применяются методы случайного мутагенеза.

В качестве модельных объектов могут использоваться
стволовые клетки, в том числе полученные из
соматических
Выводы
Can computer models replace animal
models in research?

Even though computer models are limited by
what is already known about a process or
disease, they are valuable tools that scientists
can use to suggest ideas that then can be
tested in real organisms. The information that
results from the experiments continually
enhances the computer modeling approaches.
Thus, the two types of models go hand in
hand, relying on each other to advance our
understanding of health.

Приложенные файлы

  • pdf 3307553
    Размер файла: 3 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий