раствор казеина 1% в фосфатно-солевом буфере фосфатно-солевой буфер (рН 7,5) + Твин 20 (0.05%). 1 мл. Специфические антитела.


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
На

правах

рукописи




Гофтман

Валентина

Вадимовна




СИЛАНИЗИРОВАННЫЕ КВАНТОВЫЕ ТОЧКИ:
ПОЛУЧЕНИЕ, МОДИФИКАЦИЯ

И

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В
ИММУНОАНАЛИЗЕ






02.00.02


аналитическая химия





АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата
химических наук





Саратов


2016

Работа выполнена на кафедре общей и неорганической химии

ФГБОУ ВО

«Саратовский национальный исследовательский

государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»



Научный руководитель:

доктор химических наук, доцент

Горячева Ирина Юрьевна


Официальные оппоненты:

Щеголев Сергей Юрьевич,

доктор химических наук,
ФГБУН «Институт
биохимии и физиологии растений и
микроорганизмов Российской академии наук»,
директор института


Апяри Владимир Владимирович,

кандидат химических наук,
ФГБО
У

ВО
«Московский Государственный Университет
им
ени

М.В. Ломоносова», старший научный
сотрудник кафедры аналитической химии


Ведущая организация:

ФГБОУ ВО «
Липецкий Государственный
Технический Университет

, г. Липецк




Защита состоится 22 сентября 2016 года в 14 часов на заседании
диссертационного
совета Д 212.243.07 по химическим наукам при ФГБОУ ВПО
«Саратовский

национальный исследовательский

государственный университет имени
Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, корпус 1,
Институт химии СГУ.


С диссертацией мож
но ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени
В.А. Артисевич Саратовского государственного университета имени

Н
.Г.

Чернышевского

и на сайте
http://www.sgu.ru/research/disse
rtation
-
council/d
-
212
-
243
-
07
.



Автореферат разослан «__
_
_

_______
______

2016 г.



Ученый секретарь

диссертационного совета
,

доктор химических наук





Т.Ю. Русанов
а




3


ОБЩАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность исследования.
Методы, основанные на использовании в
анализе люминесцентных меток, позволяют
детектировать

низкие
концентрации

определяемых веществ (вплоть до определения единичных структур) в самых
разнообразных форматах анализа. Воспроизводимость и чувствительность этих
методов в существенной степени определя
ю
тся качеством используемых меток.
Квантовые точки (КТ)
-

полупроводни
ковые люминесцентные нанокристаллы
-

на
сегодняшний день вытесняют традиционно используемые органические
флуорофоры в силу уникальных оптических свойств. Зависимость цвета эмиссии
от состава и размера нанокристаллов позволяет синтезировать КТ с
необходимым
и эмиссионными свойствами
;

высокая яркость и фотостабильность
дают возможность проводить длительн
ое

наблюдени
е

за меткой и детектировать
единичные КТ.

Синтез КТ изучен и освещен достаточно широко в научной литературе,
показано, что

наилучшие результаты по

яркости, стабильности и
однородности
по
размерам дает высокотемпературный коллоидный синтез в органическом
растворителе.
Кроме того,

для применения

в

анализе КТ должны образовывать
водные коллоиды
,

стабильные
при различных рН, а также иметь функциональные

группы для связывания

с биомолекулами, например, с антителами.

В связи с этим получение ярких люминесцентных КТ методом
высокотемпературного органического синтеза и придание им гидрофильных
свойств, а также модификация поверхности разл
ичными функциональными
группами
для
их последующе
го

применени
я

в анализе
являются актуальными
.

Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования является
получение
,
силанизация и функционализация

люминесцентных меток на основе
нанокристаллов
селенида кадмия структуры ядро
-
оболочка,

и их

применени
е

в
качестве люминесцентных меток в иммунохимическом анализе.

Для достижения
поставленной цели необходимо решить следующие
задачи
:

-

разработать методику покрытия КТ с разным цветом свечения оболочкой
диоксид
а кремния;

-

оценить стабильность полученных наночастиц во внешнем электрическом
поле и сравнить влияние внешнего покрытия на характеристики люминесценции;

-

оптимизировать методики функционализации

поверхности полученных
люминесцентных меток с помощью амино
-
, карбокси
-

и глицидокси
-

содержащих
органосиланов;



4


-

повысить буферную стабильность меток с помощью модификации
поверхности полиэтиленгликолем (ПЭГ
)
для дальнейшей биоконъюгации;

-

осуществить
к
онъюгирование

полученных меток с вторичными
антителами с использованием различных путей активации функциональных
групп, а также варьируя соотношение люминесцентная метка


антитело;

-

разработать

методику

твердофазн
ого

иммунофлуоресцентн
ого

определения
микотоксина дезоксиниваленола

(ДОН)
, используя синтезированную
люминесцентную
метку
,

в

микропланшетном и колоночном вариантах и
сравнить
их
чувствительность.

Методы исследования.

Для решения поставленных в работе задач
применяли комплекс физических методов

исследования (
фото
люминесценция,
УФ
-

и
видимая а
б
сорбционная спектроскопия, методы динамического рассеяния
света, электронная микроскопия
,
гель
-
электрофорез
)

и иммунохимических
методов (твердофазный иммунохимический анализ на полистиро
льн
ых
микропланшетах
, иммунохимические тест
-
колонки
с
полиэтиленовыми фритами в
качестве носителей).

Научная новизна
состоит в следующем:

-

разработана методика перевода КТ из органического растворителя в
водные растворы с сохранением оптических свойств с помощью силанизации
в
обратной микроэмульсии;

-

оптимизированы методики функционализации поверхности полученных
наночастиц карбокси
-
, амино
-

и глицидокси
-

функциональными группами;

-

показана возможность повышения буферной стабильности полученных
частиц за счет комбинировани
я функциональных групп с ПЭГ фрагментами;

-

впервые изучена стабильность водных растворов КТ во внешнем
электрическом поле;

-

впервые показано применение КТ, покрытых оболочками
диоксид
а
кремния, в качестве
люминесцентных
меток для

твердофазного
иммунофлуоресцентного определения
ДОН
.

Практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований были разработаны методики
получения стабильных в водных растворах КТ с разными цветами эмиссии и
высокими квантовыми выходами

(КВ)
. Разработаны
мет
одики

функционализации
поверхности полученных наночастиц, а также подход к повышению их буферной
стабильности. Охарактеризована стабильность гидрофильных КТ во внешнем
электрическом поле. Показано, что полученные КТ могут быть использованы в


5


качестве меток

в твердофазном иммунофлуоресцентном анализе
,

как в
планшетном, так и в колоночном вариант
ах
.

На защиту автор выносит:



Оптимизированную методику получения функционализированных
гидрофильных КТ, покрытых оболочкам
диоксид
а кремния;



Результаты исследования
з
ависимост
и

интенсивности люминесценции
полученных КТ от прил
оженного

внешнего электрического поля;



Новый подход к комбинированию функциональных групп и ПЭГ
фрагментов на поверхности наночастиц;



Разработанные иммунохимические методы с применением КТ в
каче
стве люминесцентных меток.

Личный вклад соискателя
заключается в постановке задач исследования,
выборе методов синтеза и модификации КТ, разработке методики силанизации
КТ, апробации полученных люминесцентных меток для определения
микотоксинов, непосредств
енном проведении экспериментов, обобщении и
анализе полученных результатов, формулировании выводов, написания научных
статей.

Публикации.
По теме данного исследования опубликовано
30

печатных
работ:
9

статей в журналах, рекомендованных ВАК,

4 статьи в труд
ах
международных конференций,

1
6

тезисов докладов, из них


8 на Международных
конференциях; получено решение о выдаче патента на изобретение.

Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы
представлены на следующих конференциях:
Международная научная
конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2011»
(Россия, Москва, 2011), Всероссийская научная школа
-
семинар «Методы
компьютерной диагностики в биологии и медицине


2012» (Россия, Саратов,
2012), Всероссийская школ
а
-
конференция «Химия биологически активных
веществ» молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием
«ХимБиоАктив
-
2012» (Россия, Саратов, 2012), Saratov Fall Meeting
SFM
’12, 13,14:
International

School

for

Junior

Scientists

and

Students

on

O
ptics
,
Laser

Physics

&
Biophotonics

(Россия, Саратов, 2012, 2013, 2014), VII международный конгресс
«Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 2013), V
th

International workshop on “Nanoparticles, nanostructured coatings and microcon
tainers:
technology, properties, applications” (Бельгия, Гент, 2014), 35
th

Mycotoxin Workshop
(Бельгия, Гент, 2014), XVII International Conference on Quantum Dots


6


(Великобритания, Лондон, 2015), 5
th

International Symposium on Mycotoxins and
Toxigenic Mould
s: Challenges and Perspectives (Бельгия, Гент, 2016), 26
th

Anniversary World Congress on Biosensors (Швеция, Гетебург, 2016).

Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, описания материалов и методов исследования, изложени
я
результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы,
содержащего 1
2
6

ссыл
о
к
. Работа изложена на
114

страницах, содержит 4
2

рисунк
а

и 1
5

таблиц.

Финансовая поддержка работы осуществлялась специальным проектом
Ghent

University
,
Joint

PhD

program

(
Project

01SF3012), а также проектами РНФ
(14
-
13
-
00229), МОН (4.1708.2014),
ФЦП (
14.574.21.0128
),

программой У.М.Н.И.К.
(№ 2450ГУ2/2014).


ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во
введении
обоснована актуальность проведенных исследований,
сформулирована их основная цель, описаны научная новизна и практическая
значимость полученных результатов. Введение содержит основные положения и
результаты, выносимые на защиту, сведения о достоверности и апробации
результатов.

В

главе

1

представлен обзор

литературы, в котором описаны особенности
оптических свойств КТ,
а также проведено их сравнение с традиционно
используемыми органическими флуорофорами. Рассмотрены основные а
спекты
синтеза

К
Т,
а также подробно описаны подходы
к

их
ги
д
рофилизации.

Представлена общая информация по
применению КТ в качестве люминесцентных
меток в иммунохимическом анализе.
П
риведены разработанные на сегодняшний
день
иммунохимические
методы определения

в
торичны
х

токсичных

метаболит
ов

плесневых грибков


микотоксинов

-

с

использованием КТ

различного строения

в
качестве меток
.


Глава 2

содержит описание реагентов, используемых для проведения
иммуноанализа, синтеза КТ, их силанизации и модификации.
Описаны

методы,
которые применяли для изучения свойств КТ:
фото
люминесценция
; УФ
-
, видимая
аб
сорбционная спектроскопия; электронная микроскопия.
Приведены

методики

оцен
ки

размер
а

КТ и их концентраци
и

в растворах по спектрам поглощения.
Относительный КВ
люминесценции

определяли относительно органического
люминофора с известным КВ:
родамина 6Ж (КВ 95% при
λ
возб

=490 нм).



7


Для использования полученных гидрофильных КТ в иммуноанализе
синтезировали

их

конъюгаты со вторичными антимышиными кроличьими
антителами (
IgG
). В главе приведены методики
адсорбции
иммунореагентов
на
поверхности полистирольных
микропланшет
ов

и пористы
х

полиэтиленовы
х

подлож
е
к (фрит
ов
); проведения иммунофлуоресцентного анализа в колонках

и на
микропланшетах
. Количественную оценку результатов выполняли на основе
интенсивности
люминесценц
ии

КТ с помощь
ю ридера для микропланшетов
Tecan

Safire

2

(
Tecan
)
.


В
главе 3

описаны методики синтеза КТ на основе
селенида кадмия (
CdSe
)

с
различным
количеством

оболочек более широкозонного полупроводника (
CdS

и/
или
ZnS
)
.

Для этого

получали я
дра
CdSe

методом высокотемпературного
синтеза в органическом растворителе
октадецене
-
1

в инертной атмосфере аргона

по методикам, разработанным ранее
.

В качестве стабилизирующих
л
игандов
использовали триоктилфосфин и
ли

олеиновую кислоту.

Относительный
КВ ядер
CdSe

с
оставлял

не более

5
%.
Для повышения интенсивности люминесценции ядер
CdSe

их покрывали оболочками более широкозонных полупроводников.
Наращивание таких оболочек
предотвраща
е
т безызлучат
ельные переходы в
нанокристалле

за счет разницы в
значениях
ширин
ы

запрещенных зон.
Также
оболочка защищает люминесцирующие ядро от окружающей среды, таким
образом, уменьшая подверженность ядра внешним воздействиям.
ZnS

является
лучшей оболочкой для
CdSe
, поскольку
значения
ширин
ы

запрещенн
ой

зон
ы

отлича
ю
тся примерно в 1
.5 раза.
Важным параметром выбора материала оболочки
является близость параметров кристаллической решетки.
Оболочка
CdS

используется как промежуточная, поскольку позволяет снижать напряжение в
кристалле.
Более того,
постепенное

наращивание оболочек позволя
ет
контролировать положение максимума пика эмиссии (рис. 1).

Б
ыли получены КТ с разным количеством оболочек и, соответственно, разной
длиной волны люминесценции.
П
олучили КТ структуры
CdSe
/
ZnS

с зеленым
цветом эмиссии

возб
= 490 нм для всех образцов, λ
люмин
=550 нм, КВ 50%),
CdSe/CdS/CdZnS/ZnS с оранжевым цветом эмиссии (λ
люмин
=600 нм, КВ 53%) и
CdSe/CdS/ZnS с красным цветом эмиссии (λ
люмин
=630 нм, КВ 36%) (рис. 2
)
.




8




Рисунок 1.
С
пектры люминесценции КТ структуры
CdSe
/
CdS
/
ZnS

с различным количеством
оболочек
(
интенсивность люминесценции приведена на

основании рассчитанных квантовых
выходов)

и вид соответствующих образцов
в

УФ
об
лучени
и




Рисунок
2
. Спектры
люминесценции

полученных КТ


На сегодняшний день

существуют различные способы модификации
пове
рхности КТ, которые позволяют не только придавать им гидрофильные
свойства, но также защища
ю
т от воздействия окружающей среды (например,
окисления), и
предотвраща
ю
т проникновение в

окружающую среду ионов


9


тяжелых металлов.
В связи с этим,
г
лава 4


посвящена разработке методики
гидрофилизации КТ
путем

силанизации с помощью

метода обратной
микроэмульсии.

Метод обратной микромульсии основан на контролируемом гидролизе
силанизирующего агента в наноразмерных термодинамически устойчивых

каплях


воды, ста
билизированных
в органической фазе
молекулами
поверхностно
-
активного вещества (ПАВ)

-

мицеллах
.
Метод позволяет получать
узкое распределение по размерам частиц, в силу того, что мицеллы в
микроэмульсии имеют
близкие

размер
ы
.

При создании микроэмульсии

важную роль играет соотношение
компонентов
в системе вода
-

ПАВ
-

органическая фаза, поскольку
оно

влияет на
размер и стабильность образовавшихся мицелл.
К
оличество добавляемых КТ
позволяет варьировать число КТ в каждой из мицелл.
Т
олщина оболочки
диоксид
а
кремния, а соответственно, и стабильность получаемых гидрофильных КТ зависит
от количества добавляемого органосилана. Таким образом, концентрации и
соотношения этих пяти компонентов оказывают значительное влияние на
качество получаемого продукта.
В связи

с этим
был подобран
оптимальн
ый состав
микроэмульсии: 1 мл гексана, 0.32 мл неиногенного ПАВ
Brij

L
4, 50 мкл воды, 1
нмоль КТ в хлороформе, 30 мкл
т
етраэтоксисилан
а

(
ТЭОС
)

и 10 мкл 25% раствора
аммиака, используемого в качестве катализатора процесса гидро
лиза.

Контроль

качества получаемых наночастиц

проводили с помощью
просвечивающей
электронной микроскопии (рис. 3).

Поскольку оболочка широкозонного полупроводника выполняет защитную
роль, не только запирая пару электрон
-
дырка внутри ядра
, но и ограждая ядро
от
воздействия окружающей среды,

то ее толщина влияет на сохранение оптических
свойств КТ после гидрофилизации. В таблице
1
представлены значения
относительного КВ для различных типов КТ до и после силанизации.

Н
аилучший результат пока
зывают КТ
600
,
которые

помимо слоев
CdS

и
ZnS

имеют промежуточный
CdZnS

слой.
Для таких КТ
после силанизации КВ падал
незначительно: с 53% для исходных КТ до 43% для гидрофильных КТ. Более того,
при
хранении
, эти

КТ сохраняют свои оптические свойства.

В

последующих





Автор выражает благодарность
Prof
.
Dr
.

Zeger

Hens

(
Ghent

University
) за всестороннюю
помощь и предоставленную возможность проведения экспериментов в
лаборатории
научной
групп
ы
Physics and Chemistry of Nanostructures
,
Faculty

of

Science
,
Ghent

University
,
Ghent
,
Belgium
.



10


экспериментах испо
л
ьзовали КТ
600

со структурой
CdSe
/
CdS
/
CdZnS
/
ZnS

и
максимумом длины волны испускания 600 нм
.




Рисунок 3.
С
иланизированны
е

КТ,
синтезированные
при оптимальных соотношениях
компонентов микроэмульсии

(изображение

получено

с помощью просвечивающего
электронного микроскопа)

Таблица 1.
Квантовый выход
(КВ)
КТ

различной структуры до и после силанизации, а
также через месяц после приготовления

КТ

Структура

λ
л
юмин
, нм
*

КВ, %

до
силанизации

после
силанизации

после 1
месяца
хранения

КТ
550

CdSe
/
ZnS

550

50
5

10
2

-

КТ
600

CdSe
/
CdS
/
CdZnS
/
ZnS

600

53
6

43
3

41
5

КТ
630

CdSe
/
CdS/ZnS

630

36
4

22
4

19
4

*

λ
возб

=
490

нм


Для
применения КТ в анализе
важна

конъюгаци
я

КТ с различными
биологическими молекулами, например, антителами
,
содер
жащими
амино
-

и
карбокси
льные

группы
. В связи с этим
важно получить КТ,
способные
образовывать
химические
связи с такими
группами
.

П
осле гидролиза молекул ТЭОС на поверхности КТ образуются
гидроксильные группы
, которые

сложно связать с карбоксиль
ной г
руппой или с
аминогруппой.
Следует отметить, однако, что такой первичный слой,
образующийся после гидролиза ТЭОС, легко модифицировать, поскольку
органосиланы имеют схожую структуру
(таблица 2)
и все они склонны к реакциям
конденсации
.



11


Метод микроэмульсии
очень удобен

(рис. 4)
, поскольку в
этом случае модифицирующий
реагент вводят непосредственно в
реакционную смесь,
уже
после
формирования первичной
оболочки
диоксид
а кремния.

Для оценки качества
полученных КТ определяли их
относительный
КВ
;
коллоидную
стабильность полученных частиц
оценивали, измеряя значения
дзета
-
потенциала (таблица 3).
Д
ля
повышения стабильности в
одных
растворов КТ и уменьшения
неспецифического
взаимодействия с биомолекулами

в поверхностный слой КТ
включали ПЭГ фрагменты.

Для
этого использ
овали

ПЭГ
-
производные органосиланов


в
комбинации с описанными выше
модифицирующими агентами.
В
результате удал
ось добиться
высокой буферной стабильности полученных модифицированных
силанизированных КТ (рис. 5).


Таблица
2
.
О
рганосиланы, используемые для

силанизации и

функционализации
КТ

Название

Структура

Тетраэтоксисилан

(ТЭОС)


3
-
м
еркаптопропилтри
-
метоксисилан

(МПС)


3
-
аминопропилтриме
-
токсисила
н (АПС)


(3
-
г
лицидоксипропил
)
-
триметоксисилан

(ГОПТЭС)


Карбоксиэтилсилан
-
триол, натриевая соль

(КЭСТ)


2
-
метокси
-
полиэтиленоксипроп
илтриметоксисилан
(МПЭГТМС)


Таблица 3. Значения квантовых выходов

(КВ)

и
дзета
-
потенциалов для силанизированных КТ,
модифицированных указанными
органосиланами


Модифицирующий
агент

КВ, %

дзета
-
потенциал, мВ

ТЭОС

43
3

-
20 (4)

АПС

40
4

+ 14 (5)

КЭСТ

40
3

-

34 (5)

ГОПТЭС

40
3

-

50 (4)



12




Рисунок 4. Схема
силанизации и функционализации

КТ
в

микроэмульсии




Рисунок
5
. Стабильность амино
-
модифицированных силанизированных

КТ по сравнению с их
ПЭГилированными аналогами

Для успешного использования в качестве люминесцентных меток
,

водные
коллоиды КТ должны не только обладать достаточными люминесцентными
свойствами и быть стабильными в широком диапазоне рН и ионной силы, но
также сохранять свои оптические свойства при внешнем воздействии, например,
под действием
приложенного

электри
ческого поля.
Стабильность
КТ

в
электрическом поле важна, поскольку
КТ

часто используются
как метки
при
проведении разделения и идентификации белков с помощью электрофореза, или в
качестве люминесцентных меток в электрохимическом иммуноанализе
.
В связи с
э
тим,
глава 5

посвящена изучению влияния электрического поля на
люминесцентные свойства КТ, покрытых амфифильным полимером на о
снове
поли
(малеиновый ангидрид
-
октадецен
-
1), модифицированного полиэфирамином
Джеффамин М1000, а также КТ, заключенных в оболочки
диоксид
а кремния,
модифицированных и не модифицированных ПЭГ (рис. 6)



13



Рисунок
6
. Схема гидр
офилизации КТ, используемых для
изучения стабильности во внешнем
электрическом поле




Рисунок 7. Схема устройства для изучения влияния внешнего
электрического поля и
зависимость силы тока и напряжения от времени при проведении эксперимента


Для

изучения
влияния

электрического поля на

интенсивность
люминесценции

водных
растворов
КТ был
и

выбран
ы

рабочи
е

концентраци
и
:
1*
10
-
9
, 3*10
-
9

и
1*
10
-
8

моль/л.
Р
аствор помещали в кювету, погружали в нее
палладиевые электроды, подключенные

к прибору

Sizer

Nano
, и
воздействовали на раствор электрическим полем с силой 10 В/см

(рис
. 7
)
.
Для
оценки изменения
интенсивности люминесценции

снимали спектры
испускания

до и после воздействия электрическим
полем

и строили графики зависимости
интенсивности люминесценции от времени воздействия (
рис.

8
).



14


Показано, что
электрическое поле существенно влияет на КТ, заключенные
в оболочки амфифильного полимера. Молеку
лы амфифильного полимера,
связанные

с лигандами на поверхности КТ только за счёт гидрофо
бного
взаимодействия, приобретаю
т дополнительные заряды в присутствии
электрического поля. Это
может
приводит
ь

к отталкиванию между молекулами
полимера и лигандами на п
оверхности КТ, а сил гидрофобного взаимодействия
недостаточно, чтобы предотвратить разрыв. Данный процесс разрушает
однородность всей амфифильной оболочки, приводя КТ в непосредственный
контакт с водой
,
что резко снижает
интенсивность
люминесцен
ции

(падени
е до 10
% от первоначального значения)
.



Рисунок
8
. Зависимость относительной интенсивности

люминесценции КТ от длительности

воздействия
электрического поля

(С =
3*10
-
9

моль/л,
λ
возб

=
490
нм,
λ
исп

=
600

нм)


В противоположность этому, оболочка
диоксид
а
кремния ковалентно
связана с поверхностью КТ, это прочная и плотная структура с диэлектрическими
свойствами.
Такая оболочка

позволяет удерживать 90 % начальной интенсивности
люминесценции, даже после более длительного воздействия электрического поля.



15


В

главе 6


описано применение силанизированных КТ в качестве меток в
твердофазном иммуноанализе в непрямом конкурентном формате.

Для этого

подбирали оптимальный путь для конъюгации КТ, модифицированных
различными функциональными группами, со вторичными анти
телами.

В качестве
аналита был выбран микотоксин ДОН


один из наиболее распространенных
токсинов, продуцируемых плесневыми грибами рода
Fusarium
,
контаминирующи
ми

многие сельскохозяйственные культуры.

Для конъюгации силанизированных

КТ, имеющих аминогруппы на
поверхности, предварительно проводили реакцию с ангидридом янтарной кислоты

(рис. 9
-
I
)
, приводящую к образованию карбоксильных групп на поверхности КТ.
Затем

применяли

метод активированных эфиров (карбодиимидно

сукцинимидный) (р
ис. 9
-
II
).

Для конъюгации силанизированных КТ,
модифицированных карбоксильными группами, использовали метод
активированных эфиров без предварительной реакции с ангидридом янтарной
кислоты. Силанизированные КТ, модифицированные глицидоксигруппами, не
требую
т активации, поэтому КТ смешивали с антителами и инкубировали в
течении 12 часов.

Связывание КТ со вторичными антителами подтверждали с помощью гель


электрофореза

в агарозе

и иммунохроматографических тестов. С помощью гель
-
электрофореза также определ
и
ли оптимальное соотношение КТ:антитела, которое
составило 1:5.
Далее проводили предварительные тесты на чувствительность
полученных конъюгатов, по результатам которых оптимальным был признан
конъюгат на основе амино
-
модифицированных силанизированных

КТ.


Д
ля проведения
иммуноанализа

на подложку наносили ко
нъюгат

определяемый аналит
-

белок, затем
смесь анализируемого раствора и
специфичны
х

к аналиту антител

в выбранной концентрации
, а затем
видоспецифичные вторичные антитела против первичных антител. При эт
ом
только вторичные антитела
с
коньюгированы с КТ
. К
омплекс антиген
-
антитело
дает люминесцентный сигнал только после связывания со вторичным антителом,
что позволяет избежать неспецифических реакций.

В качестве носителя
использовали

полистирольные
микропланшеты (классический твердофазный
иммуноанализ) и полиэтиленовые фриты (колоночный формат, тест
-
метод). Для





Автор выражает благодарность
Prof
.
Dr
.
S
arah

De

Saeger

(
Ghent

University
) за всестороннюю
помощь и предоставленную возможность проведения экспериментов в научной
лаборатории
Анализа Пищевых Продуктов
(
Laboratory

of

Food

Analysis
,
Faculty

of

Pharmaceutical

Science
,
Ghent

University
,
Ghent
,
Belgium
)



16


повышения чувствительности проводили оптимизацию процесса, варьируя
концентрации,
состав
буферны
х

раствор
ов

и время инкубации иммунореагентов
.





























Рисунок
10
.
Градуировочные

зависимости

для определения ДОН твердофазными
иммунофлуоресцентным анализом

на микропланшетах

и фритах
.
I
/I
0



относительный аналитический
сигнал: интенсивность люминесценции (
λ
возб

= 490 нм,
λ
исп

= 600 нм

)
,
n

= 3.



17


Для
определения оптимальных условий проведения анализа

варьировали
концентраци
и

иммунореагентов и конъюгата КТ
-
антитела,
состав и объем
буферны
х

растворов используемых для инкубации и промывки
, а также
блокирующий агент. Оптимальные
параметры представлены в таблице 4.

В найденных
оптимальных условиях были проанализированы модельные
растворы ДОН в широком диапазоне концентраций. На рис.
10
представлен
ы

градуи
р
овочн
ые

зависимости

с доверительными интервалами, построенными на
основании трех параллельных экспериментов.
В таблице 5 представлены
аналитические характеристики разработанных методик.

Для
подтверждения

правильности разработанной методики
иммунофлуоресцентного иммуноанализа

в микропланшетном формате
использовали

метод введено
-
найдено. Проводили анализ образцов пшеницы и
кукурузы, искусственно контаминированных ДОН
,

в

интервале концентраций 0


100 мкг/кг
. Получ
а
ли
адекватную линейную аппроксимацию

результатов анализов

(R
2
=0,9823 для пшеницы и R
2
= 0,9816 для кукурузы)
.


Для валидации метода проводили анализ

натурально контаминированных
образцов пшеницы. Полученные данные сравнивали с результатами, полученными
Таблица 4. Оптимальные параметры проведения иммуноанализа


Параметр

Микропланшет

Фрит

Конъюгат ДОН
-
овальбумин

разведение 1:15000

объем 0,1 мл

разведение 1:1500

объем 0,1 мл

Буфер для
нанесения

ДОН
-
овальбумин

карбонатный буфер

рН 9,6

Блокирующий агент

раствор казеина 1% в фосфатно
-
солевом буфере

Промывающий буфер

фосфатно
-
солевой буфер

(
рН 7,5)

+ Твин 20
(
0.05%
)

1 мл

Специфические антитела

разведение 1:20000

объем 0,05

мл

разведение 1:2000

объем 0,05 мл

Буфер для
специфических антител

фосфатно
-
солевой буфер

рН 7,5

Конъюгат КТ
-
вторичные
антитела

разведение 1:200

объем 0,1 мл

разведение 1:2

объем 0,1 мл

Буфер для конъюгата
КТ
-
вторичные анитела

фосфатно
-
солевой буфер

рН 7,5

Объем исследуемого
образца

0
,
05

мл

1 мл



18


методом жидкостной хроматографии с масс
-
спектрометрическим
детект
ированием (ЖХ
-
МС
/МС
). Для
11
образцов пшеницы, контаминированных
выше, чем предел обнаружения

(12 мкг/кг)

метода ЖХ
-
МС
/МС
, построена
корреляционная зависимость концентраций, найденных с помощью
разработанно
го

способа
, и концентраций, найденных ме
тодом
ЖХ
-
М
С
/МС
.
Линейная аппроксимация результатов указывает

на правильность разработанной
методики

(
R
2
=0
,
9902)
.



ВЫВОДЫ


1.


Разработан способ синтеза
, силанизации
и
функционализации

КТ для
использования в
их
качестве люминесцентных меток в иммунохимических
метода
х

анализа
.

2.

Разработана методика гидрофилизации КТ за

счет силанизации их
поверхности
в

обратной микроэмульсии, позволяющая получать
силанизированные КТ с контролируемой тол
щиной гидрофильной оболочки
и

узким распределением по размерам. Показано, что данная методика
применима к КТ

на основ
е селенида кадмия

с различным строением
оболочек
и позволяет сохранять люминесцентные свойства исходных
гидрофобных КТ
.

Квантовый выход люминесценции полученных КТ
сост
авляет около 40 %
.

3.

Развит подход к

модификации поверхности полученных силанизированных
КТ различными функциональными группами

(амино
-
, карбоксильной,
глицидокси
-

группами, а также ПЭГ фрагментами)
.
Проведено комплексное
исследование свойств полученных
наночастиц.
Установлено, что





IC
50




концентрация аналита, при которой интенсивность аналитического сигнала составляет
50% от

исходного. Данная характеристика показывает чувствительность метода: чем ниже IC
50
,
тем чувствительнее метод.


Таблица 5. Аналитические показатели определения ДОН разработанными методиками
иммунохимического анализа

Носитель

микропланшет

фрит

Предел обнаружения,

мкг/мл

0,05

0,005

IC
50

, мкг/мл

0,47
0


0,02
0


Интервал линейной зависимости
, мкг/мл

0,
15
0



1
,
00
0


0,00
8


0,0
55



19


функционализация поверхности силанизированных КТ несущественно
влияет на их люминесцентные свойства и коллоидную стабильность.
По
казано
, что модифи
кация

поверхности люминесцентной метки с
помощью ПЭГ существенно повышает буферн
ую стабильность полученных
наночастиц.
Получены конъюгаты модифицированных силанизированных
КТ со вторичными антителами.

4.

Обнаружена
чувствительность интенсивности люминесценции

водного
коллоида
КТ
к воздействию

внешне
го

электрическо
го

пол
я.

Установлено,

ч
то
КТ, покрытые амфифильным полимером, теряют
до 90 %
яркости
люминесценции п
ри

воздействи
и

электрическ
ого

пол
я (
2
,
5 мин

с
силой поля

10 В/см
)

из
-
за

непрочного связывания молекул полимера с поверхностью
КТ.
Интенсивность люминесценции
с
иланизированны
х

КТ
снижается
незначительно (
на 10
%
от начального
з
н
а
чения за 5

мин

воздействия
)

благодаря ковалентному связыванию КТ с прочной оптически прозрачной
оболочкой
диоксид
а кремния.

5.

Р
азработаны

методики конкурентного твердофазного
иммунофлуоресцентного анализа
пр
и использовании синтезированных
конъюгатов КТ
-
вторичные антитела
.
О
п
тимизированы условия проведения
анализа

с использованием полистирольных микропланшетов в качестве
носителей.
На примере определения микотоксина
ДОН

установлено
, что

данн
ый способ

характеризуется
IC
50

0,
47
мк
г/мл
.
Предложен твердофазный
иммунофлуоресцентный колоночн
ый

способ

определения ДОН

с
использованием пористых полиэтиленовых фритов в качестве носителя.
Показано, что данный подход позволяет существенно сократить время
анализа,
при этом
IC
50

составляет

0,0
2

мк
г/мл
.


СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1.

Goftman V.V
., Aubert T., Vande Ginste D., Van Deun R., Beloglazova
N.V., Hens Z., De Saeger S., Goryacheva I.Yu. Synthesis,
modification, bioconjugation
Biosensors and Bioelectronics.
-

2016.
-

Vol. 79.
-

P. 476

481.

2.

Goftman V.V.
, Pankratov V.A., Markin A.V., Vande Ginste D., De Saeger
S., G
oryacheva I.Yu. Hydrophilic quantum dots stability against an external low
-
strength electric field.// Applied Surface Science.
-

2016.
-

Vol. 363.
-

P. 259

263.



20


3.

Di Nardo F., Anfossi L., Giovannoli C., Passini C.,
Goftman V.V.
,
Goryacheva I.Y., Baggiani C. A
fluorescent immunochromatographic strip test using
Quantum Dots for fumonisins detection.// Talanta.
-

2016.
-

Vol. 150.
-

P. 463

468.

4.

Skaptsov A.A.,
Goftman V.V.
, Galushka V.V., Markin A.V., Kochubey
er: CdSe/ZnS vs.
CuInS
2
/ZnS.// SPIE Proceedings.
-

2016.
-
Vol. 9917.
-

№12.


5.

Goftman V.V.,

Markin A.V., De Saeger S., Goryacheva I.Yu. Multicolored
silica coated CdSe core/shell quantum dots.// SPIE Proceedings.
-

2016.
-

Vol. 9917.
-

№16.

6.

Novikova A.S.,
Goftman V.V.
, Goryacheva I.Yu. Synthesis of cadmium
-
free quantum dots based on CuInS
2

nanocrystals.// SPIE Proceedings.
-

2016.
-

Vol.
9917.
-

№14.

7.

Goftman V.V.
, Gaynbuch A.V., Panfilova E.V., Khlebtsov B.N.,
Goryacheva I.Yu. Freeze
-
dried polymer
-
coated quant
um dots for perspective biomedical
application.// SPIE Proceedings.
-

2015.
-

Vol. 9448.
-

№9.

8.

Goryacheva I.Yu., Speranskaya E.S.,
Goftman V.V.
, Tang D., De Saeger
S. Synthesis and bioanalytical applications of nanostructures multiloaded with quantum
dots.//
Trends

in

Analytical

Chemistry
.
-

2015.
-

Vol
. 66.
-

P
. 53

62.


9.

Гофтман В.В.
, Вострикова А.М., Горячева И.Ю. Изменение
флуоресцентных свойств квантовых точек в процессе силанизации.// Известия
Саратовского университета. Новая серия. Серия: Физика.
-

2015.
-

Т.
15
.
-

№ 1.
-

С.
32
-
35.

10.

Beloglazova N.V., Speranskaya E.S., Wu A., Wang Z., Sanders M.,
Goftman V.V.
, Zhang D., Goryacheva I.Yu., De Saeger S. Novel multiplex fluorescent
Biosensors
and Bioelectronics.
-

2014.
-

Vol.12.
-

№ 62.
-

P. 59
-
65.

11.

Сперанская Е.С.,
Гофтман В.В.
, Горячева И.Ю. Приготовление
водорастворимых квантовых точек
CdSe
/
ZnS

с кристаллической структурой
сфалерита.// Российские нанотехнологии.
-

2013.
-

T
. 8.
-

№1
-
2
.
-

C
. 100
-

1
04.

12.

Goftman V.V
., Beloglazova N.V., Njumbe Ediage E., De Saeger S.,
-
2 and HT
-
-

2012.
-

Vol. 4.
-

P. 4244
-

4249.

13.

Сперанская
Е.С.,
Гофтман В.В.
, Дмитриенко А.О., Дмитриенко В.П.,
Акмаева Т. А., Потапкин Д.В., Горячева И.Ю. Синтез гидрофобных и
гидрофильных квантовых точек ядро
-
оболочка.// Известия Саратовского


21


Университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология.
-

2012.
-

T
. 12.
-

№.
-

C
. 3


11.

Патент

1.

Горячева И.Ю.,
Гофтман В.В.
, Сперанская Е.С., Сухоруков Г.Б.
«Способ выделения и очисти квантовых точек, заключенных в оболочки оксида
кремния». №2014115560 приоритет 17.04.2014
.

Материалы научных конференций, конгрессов и
симпозиумов:

1.

Goftman V.V.
, Goryacheva I.Yu., De Saeger S. Quantum dot
-
based
luminescent nanobiolabels: synthesis and bioapplication.


26
th

Anniversary World
Congress on Biosensors, Gothenburg, Sweden, 25
-
27 May 2016, p.

2.

Goftman V.V.
, Goryacheva I.Yu
., De Saeger S.
Development of
immunochemical test for mycotoxin detection using luminescent nanobiolabel.
-

5th

International

Symposium

on

Mycotoxins

and

Toxigenic

Moulds:

Challenges

and

Pers
pectives,

Ghent,

Belgium
,

11th

of

May

2016
, p. 83.


3.

Goftman

V.V.
, Pankratov

V.A.
, Markin

A.V.
, Aubert

T.
, Hens

Z.
,
D
e
Saeger

S.
, Goryacheva

I.Yu
. Impact of Electric Field on the Optical Properties of
Hydrophilic Quantum Dots.
-

XVII International
Conference on Quantum Dots, London,
Great Britain, 10
-
11 December 2015, p. 1085.

4.

Goftman V.V.
,

A.V., D
e Saeger

S.
, Goryacheva

I.Yu.

Silica
-
coated CdSe based quantum dots with high buffer stability
.
-

Saratov Fall Meeting
SFM'14 XVI International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser
Physics & Biophotonics
,
Саратов
, 23
-
26
сентября

2014
.

5.

Goftman V.V.
, Goryacheva I.Yu. Synthesys of silica
-
coated core
-
shell
quantum dots.
-

Vth Internat
ional workshop on “Nanoparticles, nanostructured coatings
and microcontainers: technology, properties, applications” Ghent, Belgium, 9
-
12 May
2014, p. 30.

6.

Goftman V.V.
, Speranskaya E.S., Goryacheva I.Yu. Approaches to
hydrophilization of quantum dot for
using as biolabels
.
-

Материалы

VII
международного

конгресса


Биотехнология
:
состояние

и

перспективы

развития
,
Москва
,
18
-
20
марта

2014,
с
. 133.

7.

Goftman V.V.
, Goryacheva I.Yu. Synthesis of SiO
2
-
coated CdSe/CdS/ZnS
quantum dots nanohybrids
.
-

Saratov Fall
Junior Scientists and Students on Optic
s, Laser Physics & Biophotonics,
Саратов
, 25
-
28
сентября

2013
.

8.

Goftman V.V.
, Speranskaya E.S., De Saeger S., Hens Z., Goryacheva
I.Yu. Synthesis of multicolored labels based

on CdSe quantum dots for
-

35th Mycotoxin Workshop, Gent, Belgium, 22
-
24 May 2013, p. 110.

9.

Гофтман В.В
., Сперанская Е.С. «Гидрофильные квантовые точки:
синтез и применение в качестве биометок Материалы
VII

международного


2
2


конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития»,
Москва, 18
-
21
марта
2013, часть 1, с. 89
-

90.

10.

Гофтман В.В.
, Сперанская Е.С, Горячева И.Ю. Синтез и применение
усиленной флуоресцентной метки на основе квантовых точек и неорганич
еских
наноносителей в иммунохимических тест
-
методах
.

Материалы всероссийской
молодежной конференции «Методы компьютерной диагностики в биологии и
медицине


2012,
Саратов, 7
-
9 ноября 2012,
с.159
-

160.

11.

Гофтман

В
.
В
.,

Горячева

И
.
Ю
.
Development of immunochemical
multianalyte multilabelled immunoassay based on quantum dot
s and inorganic nano


carriers.
-

Saratov Fall Meeting SFM'12 XVI International School for Junior Scientists
and Students on Optics, Laser Physics & B
iophotonics,
Сар
атов
, 25
-
28
сентября

2012.

12.

Потапкин Д.В.,
Гофтман В.В
. Получение квантовых точек селенида
кадмия ядро


оболочка
.

Материалы итоговой студенческой конференции

Научные исследования студентов и Саратовского Государственного
Университета. Саратов, 2012.
, с. 46
-
48.

13.

Сперанская

Е.С.
,
Гофтман

В.В.
, Горячева

И.Ю.
,
Кнопп

Д.

Гидрофилизация полупроводниковых квантовых точек для применения в качестве
флуоресцентных меток.
-

Химия

биологически активных веществ
, Саратов, 24
-
28
сентября 2012
.

Межвузовский сборник научных трудов Всероссийской школы
-
конференции молодых учѐных, аспирантов и студентов с международным
участием. Саратов: ООО Изд
-
во «КУБиК». 2012. С. 289
-
290.

14.

Гофтман

В.В.
, Сперанская

Е.С.
, Потапкин

Д.В.
, Горячева

О.А.
.
Квантовые точк
и CdSe как флуоресцентные метки в иммунохимических тест
-
методах анализа природных токсикантов
.
-

Химия биологически активных
веществ
, Саратов, 24
-
28 сентября 2012.

Межвузовский сборник научных трудов
Всероссийской школы
-
конференции молодых
ученых
, аспирант
ов и студентов с
международным участием. г.

Саратов: ООО Изд
-
во «КУБиК». 2012. С. 280
-
282.

15.

Гофтман В.В.,

Сперанская Е.С. Синтез и применение квантовых
точек в биохимических тест
-
методах.
-

Материалы всероссийской молодежной
конференции «Методы компьютер
ной диагностики в биологии и медицине


2011», Саратов, 25
-
27 октября 2011, с. 244.

16.

Гофтман В.В.

Разработка иммунохимического тест
-
метод
а
определения дезоксиниваленола.
-

Материалы Международного молодежного
научного форума «ЛОМОНОСОВ
-
2011.

Москва, 11
-
15 апреля 2011
.



Приложенные файлы

  • pdf 3236931
    Размер файла: 1 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий